检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验 (ELISA) 。往 预先包被植物果糖酪氨酸(NT)酶联免疫吸附测定试剂盒 抗体的包被微孔中，依 次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。 用底物TMB显色，TMB在化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的 作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的酪氨酸(NT)酶联免疫吸附测定试剂盒 呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度  (OD 值) ，计算样品活性。

样品收集、处理及保存方法

1.  样本不能含叠氮钠 (NaN3) ，因为叠氮钠 (NaN3) 是辣根 化物酶 (HRP) 的剂。

2.  标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。

3.  植物萃取液或其它相关样本：请1000 x g离心20分钟，取上清 即可检测。

4.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存

于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪 (450nm)

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1.  试剂盒保存在 2-8℃ ，使用前室温平衡 20 分钟。从冰箱取出的 浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解 后再使用。

2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封 (低温干燥) 保 存。

3.  浓度为 0 的 S0 号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明 书操作时样本已经稀释 5 倍，最终结果乘以 5 才是样本实际浓度。

4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

注：标准品 (S0-S5) 浓度依次为：0，20，40，80，160，320 U/mL

试剂的准备

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1：20 稀释，即 1 份的20×洗涤 缓冲液加 19 份的蒸馏水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽 孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板 5 次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液 350 μL，浸泡 1min，洗板 5 次。

1.  从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自 封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μ L；

3.  样本孔先加待测样本 10 μL，再加样本稀释液 40 μL；空白孔不 加。

4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根化物酶  (HRP) 标记的检测抗体 100 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅 或恒温箱温育 60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去 洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次 (也可用洗板机洗板) 。

6.  每孔加入底物 A、B 各 50 μL，37℃避光孵育 15min。

7.  每孔加入终止液 50 μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

结果判断

绘制标准曲线：在 Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应 OD 值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样 本浓度值。