一、稀释标准曲线样品 (以 10E1- 10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)  。 由于标准品浓度非常高 ，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)  。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管 ，分别为 6 ，5 ，4 ，3 ，2 ，  1。

2.    用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液 ， 用带芯枪头， 下同)  。

3.   在 6 号管中加入 5 μL 1 × 10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟 ，得 1 × 10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。

4.   换枪头 ，在 5 号管中加入 5 μL 1 × 10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1 × 10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.   换枪头 ，在 4 号管中加入 5 μL 1 × 10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1 × 10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品， 设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC (样品制备阳性 对照)  ，一个是 NC (样品制备阴性对照)  。可以用 10μL 上步所得 4 号稀

释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积 一样 ， 以此作为 PC 。另外用水作为 NC。

8.    用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品 DNA 提取试剂

盒兼容 。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR 反应 ( 20μL 体系 ，在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复 ，则标记 N+9 个 PCR 管 ，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品 ，   1 个用于 PCR 阴性对照 (用水做模板)  ，6 个用于标准曲线 。如果做定性分析并且只做 1 次重复 ，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品 ，1 个用于 PCR 阴性对照 (用 水做模板)  ，  1 个用于 PCR 阳性对照 (直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照 稀释液做模板)  。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分 (本表只列出一次重复 。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后 加)  ：