水痘带状疱疹病毒（VZV）ELISA检测试剂盒竞争法

检测原理

试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被水痘带状疱疹病毒（VZV）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的竞争抗原，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的水痘带状疱疹病毒（VZV）呈负相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

1.  样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。

2.  标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。

3.  植物萃取液或其它相关样本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测。

4.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1.  试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.  按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

名称	96孔配置	48孔配置	备注
微孔酶标板	12孔×8条	12孔×4条	无
标准品	0.3mL*6管	0.3mL*6管	无
样本稀释液	6mL	3mL	无
竞争抗原-HRP	6mL	3mL	无
20×洗涤缓冲液	25mL	15mL	按说明书进行稀释
底物A	6mL	3mL	无
底物B	6mL	3mL	无
终止液	6mL	3mL	无
封板膜	2张	2张	无
说明书	1份	1份	无
自封袋	1个	1个	无

注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、5、10、20、40、80 pg/mL

 

 

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.  样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的竞争抗原50μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

1.  15分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；

2.  百分结合率计算：设S0管计数为B0，各标准管或样品管计数为B，非特异管计数为NSB，则百分结合率计算公式如下：B/B0=(B－NSB)/(B0－NSB)×100%

3.  logit计算:各标准点或样品管的logit值计算公式如下:logit=ln(B/B0)/(1－B/B0)

4.  将标准品的OD均值与标准品0点的OD均相除，为标准点的百分结合率，在log-logit坐标纸上绘图。

5.  Log-logit双对数标准曲线：坐标纸上横轴从左至右第一个1-9表示为第一个10进位，第二个1-9表示为第二个10进位。第三个1-9表示为第三个10进位。坐标纸纵轴为百分比（1-99），即各标准吸光值的百分结合率。取一条通过各点的直线。要求尽可能多的点在线上，同时剩余的点均匀分布在直线的两边。样品也同样由吸光值计算百分结合率，再从纵轴上的相应结合率找到直线上的点，此点对应的横坐标浓度即为样品的浓度，无须换算。

6.  人工处理：以标准浓度取log值为横坐标，对应的logit值为纵坐标在普通坐标纸上或以标准浓度为横坐标，对应的B/B0为纵坐标在logit-log坐标纸上画出标准曲线（理想化时是一条直线）。根据待测样

品的B/B0可以从坐标纸上查出样品的浓度值。如果使用普通坐标纸，查出的数值应取反对数才是最后的浓度值。

7.  自动处理：使用logit-log或四参数数据处理模式，由电脑自动计算得出结果。

8.  敏感度：1.0 pg/mL

9.  图例

 

试剂盒性能

1.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

2.  灵敏度：最低检测浓度小于1.0pg/ml。

3.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.  重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

5.  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6个月

免责声明

1.   试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

2.   严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。